茶多酚对高尿酸血症模型大鼠肾内血管损伤的干预机制研究

【摘要】背景和目的：高尿酸血症(hyperuricemia,HUA)是慢性肾脏病(chronickidneydisease,CKD)患者常见表现。同时,尿酸升高也与心血管疾病(cardiovasculardisaese,CVD)死亡率的增加密切相关。因此,HUA可能是在CKD与CVD之间起联系作用的桥梁。HUA可造成肾血管损伤,肾血管损伤进一步加快CKD进展,然而有关HUA时肾血管损伤的具体调控机制尚未完全阐明。Notch信号通路是人类生长和疾病过程中涉及血管发生和形成的一个重要传导通路；日益增多的证据表明Notch信号通路对血管及其细胞命运起关键性的调控作用；Notch通路的异常改变也与人类多种血管疾病发生密切相关。然而,在高尿酸血症CKD模式下Notch信号是否参与肾血管损伤的调控,目前尚未有相关文献报道。本文首先观察氧嗪酸诱导高尿酸血症残余肾(remnantkidney,RK)模型大鼠肾血管损伤时Notch配体Jagged-1表达,接着进一步分析其可能介导血管损伤的调控机制,并以此为切入点探讨茶多酚(teapolyphenol,TP)对高尿酸血症RK模型大鼠肾血管损伤的治疗作用,以期为CKD肾血管损伤的临床治疗提供新的理论依据。材料与方法：采用两步法制备5/6肾切除模型,氧嗪酸饲喂诱导高尿酸血症。32只雌性SD大鼠随机分为四组：假手术组(SO,n=8)；5/6肾切除组(RK,n=8)；氧嗪酸诱导5/6肾切除高尿酸血症组(RK+OA,n=8)；氧嗪酸诱导5/6肾切除高尿酸血+茶多酚处理组(RK+OA+TP,n=8)。观察24小时尿蛋白定量、血生化和肾脏病理改变。采用noticmedical6.0数码医学图像分析系统对肾小球前动脉(弓状动脉、小叶间动脉、入球小动脉)进行形态学分析；采用原位杂交法检测Jagged1mRNA在球前动脉表达；采用免疫组化检测Jagged1、Notch1细胞内结构域(Notch1intracellulardomain,Notch1-ICD)、发状分裂相关增强子5(hairyandenhancerofsplit5,Hes5)、磷酸化信号传导和转录激活物3(phosphorylatedsignaltransducersandactivatorsoftranscription3,P-STAT3)、锰超氧化物岐化酶(manganesesuperoxidedismutase,MnSOD2)及黄嘌呤氧化酶(xanthineoxidase,XO)在球前动脉中的表达；采用ELISA检测大鼠血清中活性氧(reactiveoxygenspecies,ROS)水平。结果：1.与SO组相比较,血清尿酸在RK组(86.50±13.81μmol.L-1vs98.51±17.75μmol.L-1,P>0.05)和RK+OA组(86.50±13.81μmol.L-1vs207.23+29.82μmol.L-1,P<0.01)升高。RK+OA组血尿酸升高更显著,与RK组相比有明显差异(98.51±17.75μmol.L-1vs207.23+29.82μmol.L-1,P<0.01)。2.与SO组相比较,反映肾脏功能的血生化参数和结构改变的病理评分在RK和RK+OA组明显增加(P<0.05),RK+OA组增加更显著,与RK组比较有明显差异(P<0.05)。随着血尿酸水平增加,反映肾脏功能的血生化参数和结构改变的病理评分增加(P<0.05)。3.与SO组相比较,RK组和RK+OA组肾小球前动脉中层/管腔值明显增高(P<0.01)。其中,RK+OA组较RK组增高更显著,表现为弓状动脉(5.71±0.68versus3.44±0.56,P<0.01);小叶间动脉(5.18±0.91versus3.77±1.04,P<0.01);入球小动脉(8.21±0.78versus5.05±0.97,P)<0.01)。随着血尿酸水平增加,肾小球前动脉中层/管腔值增加；随着肾小球前动脉中层/管腔值增加,反映肾脏功能的血生化参数和结构改变的病理评分增加(P<0.05)；24小时尿蛋白定量增加(P<0.05)。4.与SO组相比较,RK组和RK+OA组肾小球前动脉Jagged-1表达明显减少(P<0.01),Jagged-1mRNA表达亦明显减少(P<0.01),且两者表达均与动脉中层/管腔值呈负相关(P<0.01)。两者表达在RK+OA组减少更显著,与RK组比较有明显差异(P<0.01)。5.与SO组相比较,RK组和RK+OA组肾小球前动脉中Notch1-ICD、Hes5、P-STAT3和MnSOD2表达均下调(P<0.01)；其中RK+OA组下调更明显,与RK组比较有显著差异(P<0.05)。6.与SO组相比较,RK组和RK+OA组肾小球前动脉中XO表达上调(P<0.01);RK+OA组上调更明显,与RK组比较有显著差异(P<0.01)。7.Jagged-1、Notch1-ICD、Hes5、STAT3和MnsOD2表达水平随动脉损伤程度加重逐渐下调(P<0.01)；然而,XO表达水平随动脉损伤程度加重上调(P<0.01)。8.随着Jagged-1表达下调,Notchl-ICD、Hes5、STAT3和MnSOD2表达下调(P<0.01)。9.血清ELISA显示ROS水平随动脉损伤程度加重而升高(P<0.01)；随XO表达上调而升高(P<0.01)。10.比较RK组和RK+OA组,TP处理组肾小球前动脉中层管腔比值显著减少(P<0.01);XO在TP处理组肾小球前动脉表达显著降低(P<0.01)；TP处理组血清ROS水平显著减少(P<0.01)。11.比较RK组和RK+OA组,TP处理组Jagged-1和Jagged-1mRNA在肾小球前动脉表达显著上调(P<0.01)；Notch1-ICD、Hes5、P-STAT3、MnSOD2在肾小球前动脉表达亦显著上调(P<0.05)。12.相关分析证实随着Jagged-1表达上调,Notch1-ICD、Hes5、P-ST3、MnSOD2在不同分组肾小球前动脉中表达亦逐渐上调(P<0.01)。结论：1.高尿酸血症加重肾小球前动脉病变,肾小球动脉动脉病变促进肾脏病进展。2.由于血管内XO表达增加,产生ROS增多导致高尿酸血症RK大鼠肾小球前动脉损伤；由于血管内MnSOD2活性下降,清除ROS能力减少导致高尿酸血症RK大鼠肾小球前动脉损伤；在高尿酸血症RK大鼠模式下,肾小球前动脉内Notch信号通路活性下调,并协同JAK-STAT通路作用最终导致MnSOD2表达下调,从而参与血管损伤调控。3.茶多酚改善高尿酸血症RK大鼠肾小球前动脉损伤至少部分通过上调Notch信号活性减少ROS产生实现。第一章Jagged1在高尿酸血模型大鼠肾小球前动脉中的表达目的：评估氧嗪酸诱导高尿酸血症对5/6肾切除大鼠肾脏病变进展及肾小球前动脉损伤的影响,并检测Jagged-1在肾小球前动脉的表达。方法：采用两步法构建残余肾大鼠模型,然后以2%氧嗪酸饲喂模型鼠4周诱导高尿酸血症。24只SD大鼠随机分为3组：假手术组(shamoperation,SO,n=8);5/6肾切除组(remnantkidney,RK,n=8);5/6肾切除饲喂氧嗪酸组(RK+OA,n=8)。24小时尿蛋白定量、血生化指标和肾脏病理改变被评估。采用moticmedical6.0数码医学图像分析系统对肾小球前动脉(弓状动脉、小叶间动脉、入球小动脉)进行形态学分析；采用原位杂交法检测Jagged-1mRNA在肾小球前动脉中表达；采用免疫组化法检测Jagged-1蛋白在肾小球前动脉中表达。结果：1.与SO组相比较,血清尿酸在RK组(86.50±13.81μmol.L-1vs98.51±17.75μmol.L-1,P>0.05)和RK+OA组(86.50±13.81μmol.L-1vs207.23±29.82μmol.L-1,P<0.01)升高。RK+OA组血尿酸升高更明显,与RK组相比有显著差异(98.51±17.75μmol.L-1vs207.23±29.82μmol.L-1,P<0.01)。同样,反映肾脏功能的血生化参数和结构改变的病理评分在RK和RK+OA组明显增加(P<0.05),RK+OA组增加更显著,与RK组比较有明显差异(P<0.05)。比较SO组,24小时尿蛋白定量在RK组(3.05±0.99mg/24hvs5.32±1.25mg/24h,P<0.05)和RK+OA组(3.05±0.99mg/24hvs8.41±2.10mg/24h,P<0.01)明显升高,RK+OA组升高更显著,与RK组相比有明显差异(8.41士2.10mg/24hvs5.32±1.25mg/24h,P<0.01)。随着血尿酸水平增加,反映肾脏功能的血生化参数和结构改变的病理评分增加(P<0.05)；24小时尿蛋白定量增加(P<0.05)。2.与SO组相比较,RK组和RK+OA组肾小球前动脉中层／管腔比值明显增高(P<0.01)。其中,RK+OA组较RK组增高更显著,表现为弓状动脉(5.71±0.68versus3.44±0.56,P<0.01);小叶间动脉(5.18±0.91versus3.77±1.04,P<0.01);入球小动脉(8.21±0.78versus5.05±0.97,P<0.01)。随着血尿酸水平增加,肾小球前动脉中层/管腔值增加；随着肾小球前动脉中层/管腔值增加,反映肾脏功能的血生化参数和结构改变的病理评分增加(P<0.05)。3.与SO组相比较,RK组和RK+OA组肾小球前动脉Jagged-1表达明显减少(P<0.01),Jagged-1mRNA表达亦明显减少(P<0.01),且两者表达均与动脉中层/管腔值呈负相关(P<0.01)。两者表达在RK+OA组减少更显著,与RK组比较有明显差异(P<0.01)。结论：1.高尿酸血症加重肾小球前动脉病变,肾小球前动脉病变促进肾脏病进展。2.随着肾小球前动脉病变程度加重,Jagged1表达逐渐下调,Jagged1依赖Notch信号通路可能参与肾内动脉损伤的调控。第二章Notch信号通路调控高尿酸血症模型大鼠肾内血管损伤的机制目的：探讨Notch信号通路调控氧嗪酸(oxonicacid,OA)诱导高尿酸血症残余肾(RK)模型大鼠肾小球前动脉损伤的可能作用机制。方法：通过5/6肾切除后饲喂2%氧嗪酸4周构建高尿酸血症残余肾大鼠模型。24只SD大鼠随机分为3组：假手术组(shamoperation,SO,n=8)；5/6肾切除组(remnantkidney,RK,n=8);5/6’肾切除饲喂2%氧嗪酸组(remantkidneyratfed2%OA,RK+OA,n=8)。采用免疫组化法检测Jagged-1、Notchl-ICD、Hes5、STAT3、MnSOD2和口XO在不同分组大鼠肾小球前动脉中表达,以MoticMed6.0数码医学图像分析系统进行半定量分析；采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测不同分组中血清ROS水平。结果：1.Jagged-1、Notch1-ICD、Hes5、P-STAT3、MnSOD2和XO在不同分组大鼠肾小球前动脉中均有表达。2.比较SO组,RK组和RK+OA组肾小球前动脉中Jagged-1、Notch1-ICD、Hes5、P-STAT3和MnSOD2表达均下调(P<0.01)；其中RK+OA组下调更明显,与RK组比较有显著差异(P<0.05)。3.比较SO组,RK组和RK+OA组肾小球前动脉中XO表达上调(P<0.01);RK+OA组上调更明显,与RK组比较有显著差异(P<0.01)。4.Jagged-1、Notch1-ICD、Hes5、STAT3和MnsOD2表达水平随动脉损伤程度加重逐渐下调(P<0.01)。5.随着Jagged-1表达下调,Notch1-ICD、Hes5、STAT3和MnSOD2表达下调(P<0.01)。6.血清ELISA显示ROS水平随动脉损伤程度加重而升高(P<0.01)；随XO表达上调而升高(P<0.01)。结论：1.由于血管壁内XO表达增加,产生ROS增多可导致高尿酸血症RK大鼠肾小球前动脉损伤。2.由于血管壁内MnSOD2表达下降,清除ROS能力减少可导致高尿酸血症RK大鼠肾小球前动脉损伤。3.在高尿酸血症RK大鼠模式下,肾小球前动脉内Notch信号通路活性下调,导致其效应物Hes5表达下调；并协同JAK-STAT通路作用最终导致MnSOD2表达下调,从而参与肾小球动脉损伤的调控。第三章茶多酚对高尿酸血症模型大鼠肾内血管损伤的干预机制目的：评估茶多酚对HUA诱导RK大鼠肾小球前动脉损伤的治疗效果与机制。方法：通过5/6肾切除后饲喂氧嗪酸4周构建高尿酸血症RK大鼠模型。32只SD大鼠被随机分为4组：假手术组(SO)、残余肾组(RK)、残余肾喂饲2%氧嗪酸组(RK+OA)和残余肾喂饲2%氧嗪酸及茶多酚组(RK+OA+TP)。肾小球前动脉(弓状动脉、小叶间动脉和入球小动脉)病理损伤被评估。采用原位杂交法检测Jagged-1mRNA在肾小球前动脉表达；采用免疫组化法检测Jagged-1Notchl-ICD、Hes-5、P-STAT3、MnSOD2和XO在肾小球前动脉表达；采用ELISA检测血清ROS水平。结果：比较模型对照组,RK+OA+TP组肾小球前动脉中层管腔比值显著减少(P<0.01);XO在RK+OA+TP组肾小球前动脉表达显著降低(P<0.01);RK+OA+TP组血清ROS水平显著减少(P<0.01)。比较模型对照组,RK+OA+TP组Jagged-1和Jagged-1mRNA在肾小球前动脉表达显著上调(P<0.01);Notchl-ICD、Hes5、P-STAT3、MnSOD2在肾小球前动脉表达亦显著上调(P<0.05)。相关分析证实随着Jagged-1表达上调,Notch1-ICD、Hes5、P-STAT3、MnSOD2在不同分组肾小球前动脉中表达亦逐渐上调(P<0.01)。结论：茶多酚改善高尿酸血症RK大鼠肾小球前动脉损伤至少部分通过上调Notch信号活性减少ROS产生实现。
【作者】刘华；
【导师】易著文；何小解；
【作者基本信息】中南大学，临床医学，2013，博士
【关键词】高尿酸血症(HUA)；慢性肾脏病(CKD)；血管损伤；Notch信号通路；活性氧(ROS)；残余肾大鼠；茶多酚(TP)；高尿酸血症；慢性肾脏病；肾血管损伤；Jagged-1；活性氧；肾小球前动脉损伤；茶多酚；干预机制；

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